مایه پنیر از یک ماده آلی حاوی آنزیم رنین به دست می‌آید. این ماده عمدتا در لایه داخلی معده چهارم بزهای جوان، گوساله‌ها و بره‌ها یافت می‌شود. تنها زمانی در این حیوانات اتفاق می‌افتد که رژیم غذایی اصلی آن‌ها هنوز شیر باشد.
هنگامی‌که آن‌ها بزرگ‌تر شده و شروع به خوردن تنها علف می‌کنند، این آنزیم ناپدید می‌شود. چون شیر را به‌عنوان بخشی از هضم غذا تبدیل به ساختار ژلی نرم که معمولا به معنی دلمه است در می‌آورد، این ماده در معده حیوانات جوان مصرف‌کننده لبنیات به این دلیل یافت می‌شود. اما فقط حیوانات نیستند که این جزء را دارند.
گیاهانی مانند خار مریم، کنگر فرنگی و گزنه نیز حاوی نوعی آنزیم هستند. این‌ها اغلب برای تهیه پنیرهای گیاهی استفاده می‌شوند و بسیاری از آن‌ها به‌طور سنتی انتخاب پنیرسازان در مناطقی از اسپانیا و پرتقال هستند.
در بیشتر پنیرسازی ها، مایه پنیر را به‌صورت مایع یا خمیری به شیر اضافه می‌کنند. روش‌های مدرن همچنین مایه پنیر را در کاربردهای قرصی و پودری ترکیب می‌کنند، روشی که اجازه می‌دهد این ماده برای مدت طولانی‌تری در آب‌وهوای گرم‌تر ذخیره شود.
کاربرد واقعی مایه پنیر این است که ذرات جامد شیر را از آب موجود در شیر جدا کند. این اجازه می‌دهد تا کشک پنیر تشکیل شود. آنزیم‌ها تنها زمانی فعال می‌شوند که دما به 29 تا 40 درجه سانتی‌گراد برسد.
مایه پنیر به انعقاد شیر تا زمانی که مایع به 60 درجه سانتی‌گراد برسد، کمک می‌کند. این در پنیرسازی مهم است زیرا انواع مختلف پنیرها به دلیل نقش سفتی متفاوتی دارند. مایه پنیر به‌طور سنتی برای جدا کردن شیر به کشک جامد و آب‌پنیر مایع که در تولید پنیر استفاده می‌شود استفاده می‌شده است.
مایه پنیر حیوانی از منشأ گوساله برای این استفاده کمتر و کمتر می‌شود، تا جایی که امروزه کمتر از 5 درصد پنیر در جهان با استفاده از مایه پنیر حیوانی تهیه می‌شود. اکثر پنیرها اکنون با استفاده از کیموزین مشتق شده از منابع باکتریایی ساخته می‌شوند.
مایه پنیر گوساله از مخاط داخلی اتاق چهارم معده گوساله‌های جوان شیرده به‌عنوان بخشی از قصابی دام استخراج می‌شود. این معده‌ها محصول جانبی تولید گوشت گوساله هستند.
مایه پنیر استخراج‌شده از گوساله‌های مسن ( تغذیه‌شده با علف یا غلات ) حاوی کیموزین کمتر یا فاقد آن است ، اما سطح بالایی از پپسین دارد و فقط برای انواع خاصی از شیر و پنیر قابل‌استفاده است.
ازآنجایی‌که هر نشخوارکننده نوع خاصی از مایه پنیر را برای هضم شیر گونه‌های خود تولید می‌کند، مایه پنیر مخصوص شیر مانند: مایه پنیر بز برای شیر بز در دسترس است و مایه پنیر بره برای شیر گوسفند.
شکم خشک و تمیز شده گوساله‌های جوان را به قطعات کوچک برش می‌دهند و سپس به همراه مقداری سرکه در آب‌نمک یا آب‌پنیر می‌ریزند تا PH محلول پایین بیاید. پس از مدتی (یک‌شب یا چند روز)، محلول فیلتر می‌شود. مایه پنیر خام که در محلول صاف‌شده باقی می‌ماند می‌تواند برای انعقاد شیر استفاده شود. حدود 1 گرم از این محلول به‌طورمعمول می‌تواند 2 تا 4 لیتر شیر را منعقد کند.
معده‌های منجمد گوساله جوان آسیاب می‌شوند و در محلول استخراج‌کننده آنزیم قرار می‌گیرند. سپس عصاره مایه پنیر خام با افزودن اسید فعال می‌شود. آنزیم‌های معده به‌صورت غیرفعال تولید می‌شوند و توسط اسید معده فعال می‌شوند . سپس اسید خنثی می‌شود و عصاره مایه پنیر در چندین مرحله فیلتر شده و غلیظ می‌شود تا به قدرت معمولی در حدود 1:15000 برسد. یعنی 1 گرم عصاره می‌تواند 15 کیلوگرم شیر را منعقد کند. یک کیلوگرم عصاره مایه پنیر دارای حدود 0.7 گرم آنزیم فعال است - بقیه آب و نمک و گاهی اوقات بنزوات سدیم ( E211 )، 0.5٪ - 1.0٪ برای نگهداری است. به‌طورمعمول، 1 کیلوگرم پنیر حاوی حدود 0.0003 گرم آنزیم مایه پنیر است.
به دلیل محدودیت در دسترس بودن معده پستانداران برای تولید مایه پنیر، سازندگان پنیر حداقل از زمان رومیان به دنبال راه‌های دیگری برای انعقاد شیر بوده‌اند. منابع زیادی از آنزیم‌ها که می‌توانند جایگزینی برای مایه پنیر حیوانی باشند، از گیاهان و قارچ‌ها گرفته تا منابع میکروبی را شامل می‌شود. پنیرهای تولیدشده از هر یک از این انواع مایه پنیر برای گیاهخواران مناسب است.
کیموزین تولیدشده توسط تخمیر امروزه بیشتر در پنیرسازی صنعتی در کشورهای پیشرفته استفاده می‌شود زیرا از مایه پنیر حیوانی ارزان‌تر است.
مایه پنیر توسط سازمان غذا و داروی ایالات‌متحده به‌عنوان GRAS یا «به‌طورکلی ایمن شناخته می‌شود» و تایید شده است. افزودنی‌های غذایی با این نام توسط کارشناسان واجد شرایط بررسی‌شده و به‌اندازه کافی ایمن بودن آن‌ها تحت شرایط استفاده موردنظر نشان داده‌شده است.
آکادمی آلرژی، آسم و ایمونولوژی آمریکا فرض کرده است که وقتی مصرف‌کنندگان پنیر می‌خورند، آلرژی مایه پنیر ممکن است. به‌عنوان‌مثال، اگر فردی نسبت به پنیر واکنش نشان دهد و شیر گاو به‌عنوان یک آلرژن حذف‌شده باشد، ممکن است مایه پنیر یا ماده افزودنی دیگری مقصر باشد.
درواقع، تحقیقات، مایه پنیر حیوانی را به‌عنوان یک آلرژن قوی شناسایی کرده است، اما به‌طورکلی در محیط‌هایی که قرار گرفتن در معرض آن بسیار زیاد است، مانند تأسیسات تولید مایه پنیر سایر مطالعات نشان داده‌اند که هم مایه پنیر میکروبی (مشتق شده از کپک) و هم مایه پنیر حیوانی ممکن است واکنش‌های آلرژیک ایجاد کنند.
